小鼠 GDF-15 ELISA 检测试剂盒实操攻略

　　小鼠 GDF-15 ELISA 检测试剂盒实操攻略

　　一、实验前准备

　　试剂盒组分核对‌

　　确认酶标板、标准品、检测抗体、HRP亲和素、各类稀释液、洗涤液、TMB底物、终止液等组分齐全，未过有效期。

　　耗材与设备准备‌

　　准备酶标仪、离心机、恒温培养箱、多通道移液器、一次性吸头、封板膜等，提前校准移液器。

　　试剂预平衡‌

　　所有试剂从2-8℃取出，室温平衡15-30分钟;浓缩洗涤液若有结晶，37℃水浴溶解后按说明书比例稀释。

　　二、样本处理与保存

　　血清/血浆样本‌

　　用无热原无内毒素试管收集，避免溶血，3000转离心10分钟分离上清，48小时内检测，长期保存分装后-20℃冻存，严禁反复冻融。

　　组织匀浆样本‌

　　用PBS冲洗组织去除多余血液，剪为1-2mm碎块，按1g组织加10ml裂解液的比例匀浆，5000×g离心5分钟，取上清检测或分装冻存。

　　细胞上清/尿液样本‌

　　细胞上清3000转离心去除颗粒，尿液样本离心后可直接使用，4℃暂存不超过48小时。

　　三、标准品配制

　　冻干标准品加入1ml标准品稀释液，静置5分钟后轻柔涡旋，配成1000pg/ml的母液。

　　按倍比梯度依次稀释出1000、500、250、125、62.5pg/ml等系列浓度，空白孔仅加稀释液，每次实验需新鲜配制标准品并重新绘制标准曲线。

　　四、操作流程

　　加样孵育‌

　　每孔加入50μL标准品或处理好的样本，建议做双孔减少误差;加入50μL抗体混合液，室温孵育1小时。

　　洗板操作‌

　　每孔用350μL 1×洗涤液清洗3次，每次洗板后在滤纸上拍干，全程避免酶标板干燥。

　　显色终止‌

　　每孔加入100μL TMB显色液，37℃暗处孵育10-20分钟，待标准品梯度显色明显后，立即加入100μL终止液，溶液由蓝变黄。

　　读数计算‌

　　30分钟内用酶标仪在450nm波长下测定OD值，以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，要求相关系数R≥0.9900，根据样本OD值换算出对应浓度，再乘以样本稀释倍数得到最终结果。

　　五、关键避坑指南

　　无显色/显色极弱‌

　　检查试剂有效期，严禁混用不同批号试剂盒，确认孵育温度和时间符合要求，排查是否漏加HRP相关试剂。

　　背景值过高‌

　　用洗板机充分洗板，校准移液器保证加样量准确，每步使用新的封板膜，避免HRP残留。

　　结果重复性差(CV值过高)‌

　　实验全程用封板膜封口防止酶标板干燥，定期校准移液器，吸头一次性使用，避免交叉污染。

　　其他注意事项‌

　　操作时避免皮肤和眼睛直接接触终止液与TMB底物，所有实验废弃物按传染物规范处理。

　　注：以上科研产品资料供参考!

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